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線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由線粒體內外膜成分構成的非特異性且鈣離子依賴性通道。在細胞凋亡或壞死時，線粒體內容物通過膜通道孔釋放到胞漿中。線粒體膜電位的去極化（depolarization），導致膜通道孔的開放，顯著改變線粒體的通透性，使之線粒體膨脹（swelling），內容物釋放。其中鈣離子過度進入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導致膜通道孔的持續(xù)開放，而造成細胞色素C的釋放和線粒體膜電位的消失。四甲基羅丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester；TMRM），為羅丹明衍生物陽離子染料，作為電勢測定（potentiometric）熒光探針：第一，具有親脂性的； 第二，與線粒體內膜負電極結合而聚集；第三，容易進入細胞及其線粒體。四甲基羅丹明甲酯進入細胞后，被細胞內酯酶切離，產生四甲基羅丹明。四甲基羅丹明進入線粒體后，被線粒體俘獲，呈現(xiàn)強烈熒光。一旦線粒體膜通道孔開放，四甲基羅丹明釋放出來而在胞漿重新分布，其熒光性顯著降低。線粒體內熒光的變化，表明膜通道孔的開放狀態(tài)。
產品內容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO染色液（Reagent B） 微升
HEPENGBIO稀釋液（Reagent C） 毫升
產品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月
用戶自備
24孔細胞培養(yǎng)板：用于貼壁細胞染色的容器
1.5毫升離心管：用于染色工作液配制和細胞染色的容器
微型臺式離心機：用于沉淀細胞
培養(yǎng)箱：用于染色孵育
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于細胞熒光分析
熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于細胞熒光定量分析
細胞流式儀：用于細胞熒光分析
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，HEPENGBIO稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出xx微升HEPENGBIO染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升HEPENGBIO稀釋液（Reagent C），混勻后，在冰槽里靜置，并標記為HEPENGBIO染色工作液，放在暗室里。然后進行下列操作。
一、 貼壁細胞染色
1． 準備1個細胞培養(yǎng)24孔板的預處理后待測細胞（注意：可以使用載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和其它培養(yǎng)孔板，見注意事項8）
2． 小心抽去細胞培養(yǎng)液
3． 小心沿著孔壁加入xx微升37℃預熱的HEPENGBIO清理液（Reagent A）到1個細胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
4． 小心抽去清理液
5． 小心沿著孔壁加入xx微升含有HEPENGBIO染色液（Reagent B）和HEPENGBIO稀釋液（Reagent C）的HEPENGBIO染色工作液到1個細胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
6． 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘，避免光照
7． 小心抽去HEPENGBIO染色工作液
8． 小心沿著孔壁加入xx微升37℃預熱的HEPENGBIO清理液（Reagent A）到細胞培養(yǎng)孔
9． 小心抽去清理液
10． 小心沿著孔壁加入xx微升37℃預熱的HEPENGBIO清理液（Reagent A）到細胞培養(yǎng)孔
11． 選擇下列方式之一進行操作：
（A）使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：
激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――紅色熒光減弱，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強
（B） 使用熒光酶標儀檢測（定量檢測）：
放進熒光分光光度儀：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――RFU降低，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強
二、 懸浮細胞或脫離細胞染色
1． 將預處理后懸浮細胞或脫離細胞（1 X 106細胞）移入到1.5毫升離心管
2． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
3． 小心抽去上清液
4． 加入xx微升37℃預熱的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
5． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
6． 小心抽去上清液
7． 加入xx微升含有HEPENGBIO染色液（Reagent B）和HEPENGBIO稀釋液（Reagent C）的HEPENGBIO染色工作液，充分混勻
8． 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘，避免光照
9． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
10． 小心抽去上清液
11． 加入xx微升37℃預熱的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
12． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
13． 小心抽去上清液
14． 加入xx微升37℃預熱的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
15． 選擇下列方式之一進行操作：
a) 進行細胞流式儀分析：激發(fā)波長488nm氬離子激光，散發(fā)波長570nm（FL2），觀察10000個細胞以上――
波峰左移，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強
b) 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：
1）移取10微升上述細胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片
2）激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――
綠色熒光減弱，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強
c) 或使用熒光分光光度儀檢測（定量檢測）：
1）移取500微升上述細胞懸液到1毫升比色杯
2）加入xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）
3）上下傾倒混勻數(shù)次
4）放進熒光分光光度儀：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――
RFU降低，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強
產品內容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO染色液（Reagent B） 微升
HEPENGBIO稀釋液（Reagent C） 毫升
產品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月
用戶自備
24孔細胞培養(yǎng)板：用于貼壁細胞染色的容器
1.5毫升離心管：用于染色工作液配制和細胞染色的容器
微型臺式離心機：用于沉淀細胞
培養(yǎng)箱：用于染色孵育
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于細胞熒光分析
熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于細胞熒光定量分析
細胞流式儀：用于細胞熒光分析
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，HEPENGBIO稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出xx微升HEPENGBIO染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升HEPENGBIO稀釋液（Reagent C），混勻后，在冰槽里靜置，并標記為HEPENGBIO染色工作液，放在暗室里。然后進行下列操作。
一、 貼壁細胞染色
1． 準備1個細胞培養(yǎng)24孔板的預處理后待測細胞（注意：可以使用載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和其它培養(yǎng)孔板，見注意事項8）
2． 小心抽去細胞培養(yǎng)液
3． 小心沿著孔壁加入xx微升37℃預熱的HEPENGBIO清理液（Reagent A）到1個細胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
4． 小心抽去清理液
5． 小心沿著孔壁加入xx微升含有HEPENGBIO染色液（Reagent B）和HEPENGBIO稀釋液（Reagent C）的HEPENGBIO染色工作液到1個細胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
6． 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘，避免光照
7． 小心抽去HEPENGBIO染色工作液
8． 小心沿著孔壁加入xx微升37℃預熱的HEPENGBIO清理液（Reagent A）到細胞培養(yǎng)孔
9． 小心抽去清理液
10． 小心沿著孔壁加入xx微升37℃預熱的HEPENGBIO清理液（Reagent A）到細胞培養(yǎng)孔
11． 選擇下列方式之一進行操作：
（A）使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：
激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――紅色熒光減弱，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強
（B） 使用熒光酶標儀檢測（定量檢測）：
放進熒光分光光度儀：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――RFU降低，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強
二、 懸浮細胞或脫離細胞染色
1． 將預處理后懸浮細胞或脫離細胞（1 X 106細胞）移入到1.5毫升離心管
2． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
3． 小心抽去上清液
4． 加入xx微升37℃預熱的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
5． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
6． 小心抽去上清液
7． 加入xx微升含有HEPENGBIO染色液（Reagent B）和HEPENGBIO稀釋液（Reagent C）的HEPENGBIO染色工作液，充分混勻
8． 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘，避免光照
9． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
10． 小心抽去上清液
11． 加入xx微升37℃預熱的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
12． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
13． 小心抽去上清液
14． 加入xx微升37℃預熱的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
15． 選擇下列方式之一進行操作：
a) 進行細胞流式儀分析：激發(fā)波長488nm氬離子激光，散發(fā)波長570nm（FL2），觀察10000個細胞以上――
波峰左移，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強
b) 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：
1）移取10微升上述細胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片
2）激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――
綠色熒光減弱，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強
c) 或使用熒光分光光度儀檢測（定量檢測）：
1）移取500微升上述細胞懸液到1毫升比色杯
2）加入xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）
3）上下傾倒混勻數(shù)次
4）放進熒光分光光度儀：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――
RFU降低，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強
