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色氨酸羥化酶 （Tryptophan Hydroxylase；TPH；EC1.14.16.4），又稱為色氨酸單加氧酶（Tryptophan 5-monooxygenase）是芳香族氨基酸羥化酶家屬中的成員，通過將羥基基團加在色氨酸的5’位上，產(chǎn)生5-羥色胺酸（5-hydroxytryptophan；5-HTP），成為神經(jīng)傳遞介質(zhì)5-羥色胺（serotonin）的前體。色氨酸羥化酶分為2個亞型：TPH1和TPH2。前者在外周末梢和中樞神經(jīng)系統(tǒng)高度表達，例如皮膚、內(nèi)臟、松果體，后者只在神經(jīng)元上高度表達。其活性異常將導致與5-羥色胺生成信號通路（serotonergic pathway）有關(guān)的精神疾病，包括抑郁、精神分裂、強迫癥、自殺行為等的病理演變?；诘孜锷彼岷退臍渖锏剩╰etrahydrobiopterin）在色氨酸羥化酶的催化下，產(chǎn)生5-羥色胺酸和二氫生物蝶呤（dihydrobiopterin），進而使用福林-喬卡爾泰烏酚試劑 （Folin -Ciocalteu phenol reagent），在堿性條件下，與5-羥色氨酸反應(yīng)，生成藍色產(chǎn)物，在分光光度儀下（736nm波長）檢測，來定量分析色氨酸羥化酶的總活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D） 微升
HEPENGBIO顯色液（Reagent E） 毫升
HEPENGBIO強化液（Reagent F） 毫升
HEPENGBIO陰性液（Reagent G） 毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO裂解液（Reagent B）、HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）和HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）在－20℃冰箱里； 其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO顯色液（Reagent E）避免光照；有效6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
細胞刮脫棒：用于脫離細胞
DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞
（微型）臺式離心機：用于樣品制備
比色皿：用于比色的容器
分光光度儀：用于比色分析
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。
一、 樣品準備
1． 準備好25cm2細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 106細胞）
2． 小心加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細胞
6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混勻
10． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
11． 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約40下）
12． 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
13． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
14． 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
15． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
16． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
17． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、 測定準備
1． 開啟并設(shè)定好分光光度儀：波長756nm，并置零
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；HEPENGBIO顯色液（Reagent E）避免光照
3． HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
三、 背景對照測定
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent G），混勻
4． 在37℃溫度下孵育15分鐘
5． 加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent G）
6． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent E）
7． 加入xx微升HEPENGBIO強化液（Reagent F）
8． 上下傾倒數(shù)次，混勻
9． 在37℃溫度下孵育60分鐘
10． 轉(zhuǎn)移到1毫升比色皿
11． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照讀數(shù)
四、 樣品測定
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入10微升待測樣品（150微克蛋白），混勻
4． 在37℃溫度下孵育15分鐘
5． 加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent G）
6． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent E）
7． 加入xx微升HEPENGBIO強化液（Reagent F）
8． 上下傾倒數(shù)次，混勻
9． 在37℃溫度下孵育60分鐘
10． 轉(zhuǎn)移到1毫升比色皿
11． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)
五、 計算樣品活性
注意事項
1． 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照
2． 操作時，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
4． 建議使用比色皿測定
5． 樣品須澄清，至關(guān)重要
6． 測定值由低到高變化；孵育反應(yīng)可持續(xù)15分鐘
7． 比色測定后，比色皿須清洗徹底
8． 樣本測定樣品讀數(shù)高于背景讀數(shù)表明具有酶活性
9． 建議待測樣本蛋白濃度為150微克/10微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
10． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
11． 色氨酸羥化酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.4條件下，每分鐘內(nèi)能夠產(chǎn)生1微摩爾5-羥色氨酸（5-HTP）所需的酶量作為一個活性單位
12． 本公司提供系列羥化酶酶學檢測試劑產(chǎn)品
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D） 微升
HEPENGBIO顯色液（Reagent E） 毫升
HEPENGBIO強化液（Reagent F） 毫升
HEPENGBIO陰性液（Reagent G） 毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO裂解液（Reagent B）、HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）和HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）在－20℃冰箱里； 其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO顯色液（Reagent E）避免光照；有效6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
細胞刮脫棒：用于脫離細胞
DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞
（微型）臺式離心機：用于樣品制備
比色皿：用于比色的容器
分光光度儀：用于比色分析
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。
一、 樣品準備
1． 準備好25cm2細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 106細胞）
2． 小心加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細胞
6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混勻
10． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
11． 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約40下）
12． 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
13． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
14． 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
15． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
16． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
17． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、 測定準備
1． 開啟并設(shè)定好分光光度儀：波長756nm，并置零
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；HEPENGBIO顯色液（Reagent E）避免光照
3． HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
三、 背景對照測定
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent G），混勻
4． 在37℃溫度下孵育15分鐘
5． 加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent G）
6． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent E）
7． 加入xx微升HEPENGBIO強化液（Reagent F）
8． 上下傾倒數(shù)次，混勻
9． 在37℃溫度下孵育60分鐘
10． 轉(zhuǎn)移到1毫升比色皿
11． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照讀數(shù)
四、 樣品測定
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入10微升待測樣品（150微克蛋白），混勻
4． 在37℃溫度下孵育15分鐘
5． 加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent G）
6． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent E）
7． 加入xx微升HEPENGBIO強化液（Reagent F）
8． 上下傾倒數(shù)次，混勻
9． 在37℃溫度下孵育60分鐘
10． 轉(zhuǎn)移到1毫升比色皿
11． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)
五、 計算樣品活性
注意事項
1． 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照
2． 操作時，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
4． 建議使用比色皿測定
5． 樣品須澄清，至關(guān)重要
6． 測定值由低到高變化；孵育反應(yīng)可持續(xù)15分鐘
7． 比色測定后，比色皿須清洗徹底
8． 樣本測定樣品讀數(shù)高于背景讀數(shù)表明具有酶活性
9． 建議待測樣本蛋白濃度為150微克/10微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
10． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
11． 色氨酸羥化酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.4條件下，每分鐘內(nèi)能夠產(chǎn)生1微摩爾5-羥色氨酸（5-HTP）所需的酶量作為一個活性單位
12． 本公司提供系列羥化酶酶學檢測試劑產(chǎn)品
