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磷酸二酯酶（phosphodiesterase；PDE；EC2.7.1.11），又稱為環(huán)核苷酸磷酸二酯酶（cyclic nucleotide phosphodiesterase），包括腺苷-3',5'-環(huán)化一磷酸（cyclic adenine monophosphate；cAMP）或鳥苷-3',5'-環(huán)化一磷酸（cyclic guanine monophosphate；cGMP）。通過水解環(huán)核苷酸（cAMP或cGMP）的磷酸二酯鍵（phosphodiester bond）產(chǎn)生5’-核苷（5’-nucleotides），使環(huán)核苷酸失活，達到調(diào)控第二信使分子環(huán)核苷酸的水平。其中環(huán)腺苷酸（cAMP）是存在于所有生命體細胞內(nèi)重要的第二信使，以調(diào)節(jié)細胞形態(tài)、生長、分化、炎癥、蛋白磷酸化、基因轉(zhuǎn)錄等各種功能?；诎被嵝蛄?、底物特異性、調(diào)節(jié)特征、組織分布和藥理特性等，磷酸二酯酶家屬分為11種亞酶，例如PDE4/7/8是cAMP為底物；PDE5/6/9是cGMP為底物；PDE1/2/3/10是cAMP/cGMP為底物等，具有不同的生化特性、組織表達特異性和通路特征。 磷酸二酯酶5是主要的cGMP代謝性酶，存在于體內(nèi)平滑肌組織細胞里。參與cGMP的信號傳導和Corpus cavernosum以及血管平滑肌作用。PDE5抑制劑常用于治療勃起障礙和肺動脈性高血壓等?；诘孜锃h(huán)核苷酸，在磷酸二酯酶5敏感性抑制劑 （MY-5445 [1-(3-Chlorophenylamino)-4-phenylphthalazine]）存在的情況下，通過磷酸二酯酶5的催化作用，產(chǎn)生1-磷酸鳥苷產(chǎn)物后，經(jīng)由5-核苷酸酶（5-nucleotidase；5-NT）作用，釋放出游離磷酸根，進而與孔雀綠染料發(fā)生顯色反應后，通過分光光度儀（660nm波長），來定量分析磷酸二酯酶5的特異活性。磷酸二酯酶5酶連續(xù)循環(huán)反應系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO酶促液（Reagent D） 微升
HEPENGBIO底物液（Reagent E） 微升
HEPENGBIO陰性液（Reagent F） 微升
HEPENGBIO終止液（Reagent G） 毫升
HEPENGBIO顯色液（Reagent H） 毫升
HEPENGBIO標準液（Reagent I） 微升
HEPENGBIO專性液（Reagent J） 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO裂解液（Reagent B）、HEPENGBIO酶促液（Reagent D）、HEPENGBIO底物液（Reagent E）、HEPENGBIO顯色液（Reagent H）、HEPENGBIO標準液（Reagent I）和HEPENGBIO專性液（Reagent J）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO終止液（Reagent G）和HEPENGBIO顯色液（Reagent H）具有腐蝕性，避免直接用手接觸；HEPENGBIO顯色液（Reagent H）避免光照，有效6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
（微型）臺式離心機：用于樣品操作
比色皿或酶標板：用于比色分析的容器
分光光度儀或酶標儀：用于比色分析
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。
一、 樣品準備
1． 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量
2． （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入到一個液氮凍存管
5． 即刻放進液氮罐過夜
6． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
7． 放進一個15毫升錐形離心管
8． 加入置于冰槽里的xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
9． 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
10． 放進冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/em>）
11． 即刻放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
12． 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
13． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
14． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、 測定準備
1． 開啟并設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長660nm，并置零
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；HEPENGBIO顯色液（Reagent H）避免光照
3． HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
三、 標準曲線測定
1． 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
2． 按下表分別加入HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）和HEPENGBIO標準液（Reagent I）到每個離心管，混勻
3． 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表
4． 加入40微升上述配制的標準液到新的比色皿
5． 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
6． 在30℃溫度下孵育30分鐘
7． 移取xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）
8． 加入xx微升HEPENGBIO終止液（Reagent G），混勻
9． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent H），混勻
10． 室溫下靜置15分鐘，避免光照
11． 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
12． 重復實驗步驟4至11四次
13． 構(gòu)建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標（X軸）為標準5-GMP濃度（微摩爾/升）
四、 樣品背景測定
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入5微升待測樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
3． 上下傾倒數(shù)次，混勻
4． 在30℃溫度下孵育30分鐘
5． 移取xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）
6． 加入xx微升HEPENGBIO終止液（Reagent G），混勻
7． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent H），混勻
8． 室溫下靜置15分鐘，避免光照
9． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品背景讀數(shù)
10． 根據(jù)標準曲線獲得樣品背景對應5-GMP濃度（微摩爾/升）
五、 樣品總活性測定
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 上下傾倒數(shù)次，混勻
5． 在30℃溫度下孵育3分鐘
6． 加入5微升待測樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
7． 上下傾倒數(shù)次，混勻
8． 在30℃溫度下孵育30分鐘
9． 移取xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）
10． 加入xx微升HEPENGBIO終止液（Reagent G），混勻
11． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent H），混勻
12． 室溫下靜置15分鐘，避免光照
13． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)
14． 根據(jù)標準曲線獲得樣品總活性對應5-GMP濃度（微摩爾/升）
五、樣品非特異活性測定
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 加入xx微升HEPENGBIO專性液（Reagent J）
5． 上下傾倒數(shù)次，混勻
6． 在30℃溫度下孵育3分鐘
7． 加入5微升待測樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
8． 上下傾倒數(shù)次，混勻
9． 在30℃溫度下孵育30分鐘
10． 移取xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）
11． 加入xx微升HEPENGBIO終止液（Reagent G），混勻
12． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent H），混勻
13． 室溫下靜置15分鐘，避免光照
14． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)
15． 根據(jù)標準曲線獲得樣品非特異活性對應5-GMP濃度（微摩爾/升）
六、計算樣品活性
（1） 樣品總活性和非特異活性計算
（2） 樣品特異活性計算
注意事項
1． 本產(chǎn)品為20次（10個樣本）操作
2． 操作時，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過程中，標準樣品測定只需1次
4． 樣品須澄清，至關(guān)重要
5． 樣品中避免使用EDTA、EGTA、磷酸緩沖液和脫氧膽酸納處理等
6． HEPENGBIO終止液（Reagent G）和HEPENGBIO顯色液（Reagent H）具有腐蝕性，避免直接用手接觸
7． 比色測定后，比色皿須清洗徹底
8． 如果用戶沒有660nm波長，可以使用600至660nm的任一波長替代
9． 顯示綠色表明具有較強酶活性
10． 測定值由低到高變化
11． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/10微升（本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
12． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
13． 磷酸二酯酶5單位活性定義為：在30℃，pH 7.4條件下，每分鐘內(nèi)能夠水解1納摩爾環(huán)核苷酸（cGMP）至5’-核苷（5’-nucleotides）所需的酶量作為一個活性單位
14． 本公司提供系列磷酸二酯酶檢測試劑產(chǎn)品
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO酶促液（Reagent D） 微升
HEPENGBIO底物液（Reagent E） 微升
HEPENGBIO陰性液（Reagent F） 微升
HEPENGBIO終止液（Reagent G） 毫升
HEPENGBIO顯色液（Reagent H） 毫升
HEPENGBIO標準液（Reagent I） 微升
HEPENGBIO專性液（Reagent J） 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO裂解液（Reagent B）、HEPENGBIO酶促液（Reagent D）、HEPENGBIO底物液（Reagent E）、HEPENGBIO顯色液（Reagent H）、HEPENGBIO標準液（Reagent I）和HEPENGBIO專性液（Reagent J）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO終止液（Reagent G）和HEPENGBIO顯色液（Reagent H）具有腐蝕性，避免直接用手接觸；HEPENGBIO顯色液（Reagent H）避免光照，有效6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
（微型）臺式離心機：用于樣品操作
比色皿或酶標板：用于比色分析的容器
分光光度儀或酶標儀：用于比色分析
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。
一、 樣品準備
1． 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量
2． （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入到一個液氮凍存管
5． 即刻放進液氮罐過夜
6． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
7． 放進一個15毫升錐形離心管
8． 加入置于冰槽里的xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
9． 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
10． 放進冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/em>）
11． 即刻放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
12． 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
13． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
14． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、 測定準備
1． 開啟并設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長660nm，并置零
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；HEPENGBIO顯色液（Reagent H）避免光照
3． HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
三、 標準曲線測定
1． 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
2． 按下表分別加入HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）和HEPENGBIO標準液（Reagent I）到每個離心管，混勻
3． 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表
| 管號 | HEPENGBIO緩沖液（Reagent C） | HEPENGBIO標準液（Reagent I） | 標準5-GMP濃度 |
| 1 | 0 | xx微升 | xx微摩爾/升 |
| 2 | xx微升 | xx微升1號管 | xx微摩爾/升 |
| 3 | xx微升 | xx微升2號管 | xx微摩爾/升 |
| 4 | xx微升 | xx微升3號管 | xx微摩爾/升 |
| 5 | xx微升 | 0 | 0 |
4． 加入40微升上述配制的標準液到新的比色皿
5． 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
6． 在30℃溫度下孵育30分鐘
7． 移取xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）
8． 加入xx微升HEPENGBIO終止液（Reagent G），混勻
9． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent H），混勻
10． 室溫下靜置15分鐘，避免光照
11． 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
12． 重復實驗步驟4至11四次
13． 構(gòu)建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標（X軸）為標準5-GMP濃度（微摩爾/升）
四、 樣品背景測定
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入5微升待測樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
3． 上下傾倒數(shù)次，混勻
4． 在30℃溫度下孵育30分鐘
5． 移取xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）
6． 加入xx微升HEPENGBIO終止液（Reagent G），混勻
7． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent H），混勻
8． 室溫下靜置15分鐘，避免光照
9． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品背景讀數(shù)
10． 根據(jù)標準曲線獲得樣品背景對應5-GMP濃度（微摩爾/升）
五、 樣品總活性測定
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 上下傾倒數(shù)次，混勻
5． 在30℃溫度下孵育3分鐘
6． 加入5微升待測樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
7． 上下傾倒數(shù)次，混勻
8． 在30℃溫度下孵育30分鐘
9． 移取xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）
10． 加入xx微升HEPENGBIO終止液（Reagent G），混勻
11． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent H），混勻
12． 室溫下靜置15分鐘，避免光照
13． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)
14． 根據(jù)標準曲線獲得樣品總活性對應5-GMP濃度（微摩爾/升）
五、樣品非特異活性測定
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 加入xx微升HEPENGBIO專性液（Reagent J）
5． 上下傾倒數(shù)次，混勻
6． 在30℃溫度下孵育3分鐘
7． 加入5微升待測樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
8． 上下傾倒數(shù)次，混勻
9． 在30℃溫度下孵育30分鐘
10． 移取xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）
11． 加入xx微升HEPENGBIO終止液（Reagent G），混勻
12． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent H），混勻
13． 室溫下靜置15分鐘，避免光照
14． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)
15． 根據(jù)標準曲線獲得樣品非特異活性對應5-GMP濃度（微摩爾/升）
六、計算樣品活性
（1） 樣品總活性和非特異活性計算
（2） 樣品特異活性計算
注意事項
1． 本產(chǎn)品為20次（10個樣本）操作
2． 操作時，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過程中，標準樣品測定只需1次
4． 樣品須澄清，至關(guān)重要
5． 樣品中避免使用EDTA、EGTA、磷酸緩沖液和脫氧膽酸納處理等
6． HEPENGBIO終止液（Reagent G）和HEPENGBIO顯色液（Reagent H）具有腐蝕性，避免直接用手接觸
7． 比色測定后，比色皿須清洗徹底
8． 如果用戶沒有660nm波長，可以使用600至660nm的任一波長替代
9． 顯示綠色表明具有較強酶活性
10． 測定值由低到高變化
11． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/10微升（本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
12． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
13． 磷酸二酯酶5單位活性定義為：在30℃，pH 7.4條件下，每分鐘內(nèi)能夠水解1納摩爾環(huán)核苷酸（cGMP）至5’-核苷（5’-nucleotides）所需的酶量作為一個活性單位
14． 本公司提供系列磷酸二酯酶檢測試劑產(chǎn)品
